1. Traitement des données des petits ARN

Vous allez partir de l'historique que vous avez créé hier où se trouve la collection des données de séquençage des petits ARN GRH-103 et GRH-105 (voir le tutoriel).

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Contrôle qualité des lectures

Dans Galaxy vous allez utiliser l’outil FastQC Read Quality reports. Pensez à cliquer sur l'icône en forme de dossier pour accéder à votre collection.

Cliquer sur "Execute" sans modifier les paramètres.

Si aucune image ne s'affiche, rendez-vous dans les annexes pour résoudre ce problème.

En vous aidant de la notice d’utilisation du logiciel, regardez les résultats du contrôle de qualité effectué par FastQC sur votre fichier fastq.

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Suppression des séquences des adaptateurs

Les séquences obtenues sont plus longues que celles des petits ARN que l’on veut étudier. Elles contiennent donc les séquences des adaptateurs situées en 3’. Nous allons réaliser une étape de clipping qui consiste à supprimer les adaptateurs présents dans les séquences.

On va également profiter de cette étape pour ne conserver que les séquences de tailles comprises entre 18 et 30, celles correspondants aux petits ARN que nous voulons étudier.

Vous allez pour cela utiliser l’outil Clip adapter. Les réglages à modifier sont entourés en rouge.

Sur les fichiers fastq obtenus en sortie de cette étape de clipping, relancez une analyse de la qualité des séquences avec l’outil FastQC.

Vous avez la possibilité de renommer les collections en cliquant sur l'une d'entre elle et dans le nouvelle colonne qui s'ouvre à droite sur le crayon.

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Annotation des petits ARN

L’objectif de cette étape est d’annoter les éléments génomiques dans lesquels s’alignent les petits ARN qui ont été séquencés. Pour cela vous allez réaliser une série d’alignements avec le logiciel bowtie contre différentes banques d’éléments génomique de la drosophile.

Pour ce TP vous allez utiliser la version 6.18 du génome de Drosophila melanogaster dont les fichiers de séquence au format fasta sont accessibles sur le site FTP de Flybase

Dans la liste des éléments disponibles nous allons utiliser les fichiers de séquences des :

• Gènes : genes
• Introns : introns
• miRNA : miRNA
• ARN non codants : ncRNA
• piRNA clusters connus (142) : piRNA_clusters
• Transposons : transposons
• ARN divers qui contiennent les séquences des ribosomes et des snoRNA : miscRNA
• ARN de transferts : tRNA
• Transcrits : transcrits
• Et le génome de la drosophile : dmel-MAIN-chromosome-r6.18

Comme pour cette étape l’objectif est d’obtenir rapidement les fichiers d’alignements on va se concentrer sur la récupération des meilleurs alignements possibles. En vous aidant de la documentation du logiciel bowtie, répondez aux questions ci-dessous.

Nous allons utiliser l’outil sR_bowtie sur les données clippées en alignant les lectures sur un fichier d’éléments du génome de la drosophile obtenu précédemment.

Reportez vous aux annexes pour savoir comment copier les données entre historiques des fichiers fasta de référence dont vous avez besoin.

La sortie standard et l’erreur standard sont accessibles dans Galaxy. Pour cela vous devez cliquer dans votre jeu de données sur l’icône d’information (i). La page qui s’affiche vous donne accès aux paramètres de lancement de l’outil utilisé et aux différentes sorties produites.

Pour chacun des éléments d’annotation (sans oublier le génome complet de la drosophile) reportez dans le tableau Google Sheet le nombre lectures obtenues après chaque alignement.

Comme vous êtes plusieurs à travailler sur les mêmes fichiers, répartissez-vous le travail.

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Alignement des lectures sur des régions spécifiques du génome

Pour aller plus loin dans l’analyse des loci producteurs de piRNA, vous allez aligner spécifiquement les séquences que vous avez obtenues sur des régions génomiques d’intérêt. La première d’entre elle est celle du transgène P{lacW}.

Reportez vous aux annexes pour savoir comment copier les données entre historiques pour récupérer la séquence fasta de P{lacW}.

Nous allons utiliser l’outil sR_bowtie sur les données clippées en alignant les lectures sur le fichier que l’on vient de télécharger. On cherche maintenant à obtenir des alignements uniques sans ambiguïtés.

Lancez l’alignement une fois que vous avez déterminé les paramètres optimaux pour votre analyse.

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Comparaison des distributions des petits ARN entre conditions

Vous allez maintenant comparer la distribution des petits ARN sur des régions spécifiques du génome de la drosophile entre les différentes conditions biologiques que vous avez étudiées pendant la partie expérimentale.

Normalisation des échantillons

Avant de pouvoir comparer les distributions des lectures entre elles, vous devez d’abord normaliser les échantillons entre eux. Pour cela vous allez calculer le facteur de normalisation (Scaling Factor) à l’aide de la mesure en RPM (read per million) soit le ratio permettant de rapporter le nombre de lectures obtenues par banque après l'étape de clipping à un nombre de 1 million de lectures.

Distribution des lectures par taille

Vous allez ensuite réaliser des graphiques et quantifier la répartition des 3 types de petits ARN (miRNA, siRNA et piRNA) produits pour la séquence de P{lacW} à partir des lectures dans vos différents échantillons. Pour cela vous utiliserez l’outil small_rna_maps sur chacun de vos fichiers d’alignement en prenant soin d’indiquer pour chacun le facteur de normalisation permettant de corriger les lectures.

Calcul du taux d’augmentation des piRNA

Vous allez maintenant calculer le ratio d’augmentation des piRNA dans le contexte mutant. Téléchargez (icône en forme de disquette) les données obtenues en même temps que le graphique de distribution de taille. Elles vous permettent de récupérer le nombre normalisé de lecture de la taille voulue. En utilisant un tableur vous pouvez additionner les comptages piRNA (entre 23 et 29 nucléotides) et faire le rapport entre les différents génotypes.